Denaturierungsstadium
Während dieser Phase wird der Cocktail, der die Template-DNA und alle anderen Kernbestandteile enthält, auf 94-95⁰C erhitzt.
Durch die hohe Temperatur entstehen Wasserstoffbrückenbindungen?Zwischen den Basen in zwei Strängen der Matrizen-DNA kommt es zum Bruch und zur Trennung der beiden Stränge.
Dadurch entstehen zwei einzelne DNA-Stränge, die als Vorlage für die Produktion der neuen DNA-Stränge dienen.
Es ist wichtig, dass die Temperatur in diesem Stadium lange genug gehalten wird, um sicherzustellen, dass sich die DNA-Stränge vollständig getrennt haben.
Dies dauert normalerweise zwischen 15-30 Sekunden.
Glühphase
Während dieser Phase wird die Reaktion auf 50-65⁰C abgekühlt. Dadurch können sich die Primer über Wasserstoffbrückenbindungen an eine bestimmte Stelle der einzelsträngigen Matrizen-DNA binden (die genaue Temperatur hängt von der Schmelztemperatur der verwendeten Primer ab).
Primer sind einzelne DNA- oder RNA-Stränge?Sequenzen mit einer Länge von etwa 20 bis 30 Basen.
Die Primer sind so konzipiert, dass sie sich ergänzen?der Reihe nach kurze DNA-Abschnitte an jedem Ende der zu kopierenden Sequenz.
Primer dienen als Ausgangspunkt für die DNA-Synthese. Das Polymerase-Enzym kann DNA-Basen nur an einen DNA-Doppelstrang anfügen. Erst wenn der Primer gebunden ist, kann sich das Polymerase-Enzym anheften und mit der Herstellung des neuen komplementären DNA-Strangs aus den losen DNA-Basen beginnen.
Die beiden getrennten DNA-Stränge sind komplementär und verlaufen in entgegengesetzte Richtungen (von einem Ende – dem 5‘-Ende – zum anderen – dem 3‘-Ende); Daher gibt es zwei Primer – einen Vorwärtsprimer und einen Rückwärtsprimer.
Dieser Schritt dauert normalerweise etwa 10-30 Sekunden.
Ausziehbare Bühne
In diesem letzten Schritt wird die Hitze auf 72 °C erhöht, damit die neue DNA durch ein spezielles Taq-DNA-Polymerase-Enzym hergestellt werden kann, das DNA-Basen hinzufügt.
Taq-DNA-Polymerase ist ein Enzym, das aus wärmeliebenden Bakterien gewonnen wird? Thermus aquaticus.
Dieses Bakterium lebt normalerweise in heißen Quellen und verträgt daher Temperaturen über 80⁰C.
Die DNA-Polymerase der Bakterien ist bei hohen Temperaturen sehr stabil, was bedeutet, dass sie den Temperaturen standhalten kann, die zum Aufbrechen der DNA-Stränge in der Denaturierungsphase der PCR erforderlich sind.
Die DNA-Polymerase der meisten anderen Organismen könnte diesen hohen Temperaturen nicht standhalten. Beispielsweise arbeitet die menschliche Polymerase idealerweise bei 37 °C (Körpertemperatur).
72⁰C ist die optimale Temperatur für die Taq-Polymerase zum Aufbau des Komplementärstrangs. Es bindet an den Primer und fügt dann DNA-Basen nacheinander in der 5'- bis 3'-Richtung zum Einzelstrang hinzu.
Das Ergebnis ist ein brandneuer DNA-Strang und ein doppelsträngiges DNA-Molekül.
Die Dauer dieses Schritts hängt von der Länge der zu amplifizierenden DNA-Sequenz ab, dauert jedoch normalerweise etwa eine Minute, um 1,000 DNA-Basen (1 Kb) zu kopieren.
Diese drei Temperaturwechselprozesse werden 20-40 Mal wiederholt, um viele Kopien der interessierenden DNA-Sequenz zu erzeugen.
Die neuen DNA-Fragmente, die während der PCR hergestellt werden, dienen auch als Matrizen, an die sich das DNA-Polymerase-Enzym anheften und mit der DNA-Herstellung beginnen kann.
Das Ergebnis ist eine große Anzahl an Kopien des spezifischen DNA-Abschnitts, die in relativ kurzer Zeit produziert werden.