Alle Zellen geben membranumschlossene Vesikel, die zusammen als extrazelluläre Vesikel (EVs) bezeichnet werden, in ihre Umgebung ab. Diese EVs enthalten eine ausgewählte Menge an Lipiden, Nukleinsäuren und Proteinen aus ihrer Ursprungszelle und können daher eine komplexe Reihe von Informationen an umgebende oder entfernte Zellen übertragen. EVs können durch Knospen direkt aus der Plasmamembran (PM) prokaryotischer und eukaryotischer Zellen gebildet werden. In eukaryotischen Zellen können sich EVs auch zunächst als intraluminale Vesikel in den inneren multivesikulären Kompartimenten des endozytischen Pfades (MVB) bilden und dann nach der Fusion dieser Kompartimente mit der PM ausgeschieden werden. Um die Nomenklatur zu klären, wurde kürzlich vorgeschlagen, den Begriff „Exosom“ speziell für MVB-abgeleitete EVs und nicht für alle kleinen EVs zu verwenden; PM-abgeleitete EVs hingegen werden mit verschiedenen Namen wie Mikrovesikel, Mikropartikel oder Exosomen bezeichnet. Da sie an verschiedenen subzellulären Stellen gebildet werden, können Exosomen und Ektosomen unterschiedliche Sätze spezifischer Ladungen enthalten und somit unterschiedliche Funktionen haben. Aufgrund der Schwierigkeit, Exosomen von Exosomen gleicher Größe in biologischen Flüssigkeiten oder zellkonditionierten Medien zu isolieren, des Fehlens spezifischer Proteinmarker zur Unterscheidung von Exosomen von extrazellulären Körpern sowie der molekularen Mechanismen und der Fähigkeit, das eine oder andere vollständig zu identifizieren, ist dies jedoch ein ganz spezifisches Werkzeug.
1. CD63 und CD9 existieren in zwei verschiedenen und einer gemeinsamen EV-Population
Zur Untersuchung und Analyse der Verteilung von EVs wurden HeLa-Zellen verwendet. Die Ergebnisse der Immunfluoreszenz zeigten, dass sich CD63 hauptsächlich im intrazellulären Kompartiment befand. Im Gegensatz dazu findet sich CD9 hauptsächlich auf der Plasmamembran, aber auch in seltenen dunklen intrazellulären Kompartimenten. Im Steady-State wurde keine signifikante Kolokalisierung der beiden Proteine beobachtet.
2. CD63 und CD9 passieren vorübergehend späte Endosomen und PM. pHluorin ist unter sauren Bedingungen praktisch nicht fluoreszierend, fluoresziert jedoch bei neutralem pH-Wert, was es zu einem idealen Reporter für die Beobachtung der sauren späten intrazellulären MVB-Fusion mit dem Plasmamembranmolekül macht. Da die äußere Umgebung der Zelle einen neutralen pH-Wert aufweist, findet während der Fusion ein Übergang von sauer zu neutral statt. Immunelektronenmikroskopie zeigte, dass die meisten MVBs und Lysosomen zu allen Zeitpunkten nur CD63, aber nicht CD9 enthielten.
3. Im Gegensatz zu CD63 weisen CD9 und CD63-YA eine ähnliche PM-Lokalisierung und Internalisierungskinetik auf. Das lysosomale Zielmotiv wird für die RUSH-Plasmidtransfektion zu CD63-YA, CD63-WT-eGFP oder CD63-YA-eGFP mutiert. HeLa-Zellen; die Ergebnisse zeigten, dass sich CD63-YA im Steady State im Gegensatz zu CD63-WT hauptsächlich an der Zellperipherie und in einigen kleinen intrazellulären Kompartimenten befand. Die Ergebnisse der kinetischen Überwachung zeigten, dass mutiertes CD63-YA nicht in das saure innere Kompartiment eindrang; gleichzeitig zeigten die Ergebnisse, dass CD9 und CD63-YA nach der Behandlung mit Biotin ein ähnliches Verhältnis der Oberflächen- (AF647)/Gesamt-Fluoreszenzintensität (GFP) von 1 erreichten, das im Steady State weiter auf ungefähr 2 anstieg; Im Gegensatz dazu nahm das maximale Oberflächen-/Gesamtverhältnis für CD63 zu, blieb aber bis 2 Stunden nach der Zugabe von Biotin unter 1 und blieb nach 2 Stunden und im Steady-State stabil. Beim Abfall zwischen den Zuständen verhalten sich CD63-YA und CD9 ähnlich und sammeln sich auf der Plasmamembran an.
4. PM-Proteine sind in CD9-EVs angereichert, während sowohl endosomale/lysosomale als auch PM-Transmembranproteine in CD63-EVs angereichert sind. Um den Ursprung von CD63+ und CD9+ EVs besser zu bestimmen und PM oder Endosomen zu identifizieren, führten wir eine quantitative Massenspektrometrieanalyse spezifischer Marker von aus dem Körper freigesetzten EVs durch; eine quantitative Massenspektrometrieanalyse synchronisierter sezernierter CD63- oder CD9-EVs enthüllte die Eigenschaften von Plasmamembran- und Endosomen-abgeleiteten EVs, und PM-Proteine waren in CD9-EVs angereichert. , während sowohl endosomale/lysosomale als auch PM-Transmembranproteine in CD63-EVs angereichert waren.
Schlussfolgerung der Studie: Ziel dieser Arbeit war es, das tatsächliche Exosom oder die Exosomeigenschaften von EVs zu bestimmen, die verschiedene Tetraspanine enthalten. Um den subzellulären Ursprung der von diesen Zellen freigesetzten EVs zu bestimmen, verfolgten wir den intrazellulären Transport der Tetraspanine in zeitlich kontrollierter Weise von ihrer anfänglichen Synthese im endoplasmatischen Retikulum (ER) bis zu ihrer Sekretion in EVs. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sowohl CD63 als auch CD9 in kleinen Ektosomen freigesetzt werden können, die an der Plasmamembran gebildet werden, und dass Exosomen in HeLa-Zellen eine kleine Untergruppe kleiner EVs (sEVs) darstellen, die CD63 und andere späte endosomale Moleküle tragen, wie LAMP1/2. Ihre Sekretion ist besonders anfällig für eine Neutralisierung durch den endosomalen pH-Wert. BSG und SLC3A2 wurden als spezifische Marker der Ektosomensekretion in HeLa-Zellen identifiziert und waren im Gegensatz dazu unempfindlich gegenüber einer Neutralisierung des endosomalen pH-Werts. Interessanterweise verhält sich CD81, ein weiteres Tetraspanin, das häufig als Marker für Exosomen und/oder kleine EVs verwendet wird, eher wie CD9 als wie CD63. Die hier identifizierten spezifischen Marker und molekularen Mechanismen von Exosomen und Ektosomen werden den Weg für weitere Studien zur Entschlüsselung ihrer jeweiligen Funktionen ebnen.